зав. лаб. Филатов М. В., к.б.н.

Состав лаборатории:
с.н.с. -1, н.с.- 4, м.н.с. -1, ст. лаб. -1, студ. -1.
Постоянно работают в Центре:
н.с. Семёнова Е.В., к.б.н.
м.н.с. Иванов А.В.

Исследования, проводимые в лаборатории, направлены на изучение закономерностей динамической организации генетического материала клеток млекопитающих. Особое внимание уделяется проявлению факторов дестабилизации генетического материала на клеточном и тканевом уровнях и, в частности, при злокачественной трансформации клеток и процессах старения.

Основная идеологическая посылка деятельности лаборатории – полемика с тезисом, сформулированным еще Эрвином Шредингером в 1945 году в его знаменитой книге “What is life? The physical aspect of the living cell.” (в русском переводе: «Что такое жизнь с точки зрения физики?», 1947 г.), о том, что представление о стабильности генетического материала связано с представлением об «апериодическом кристалле», то есть стабильной молекулярной структуре. Позднее это фундаментальное положение трансформировалось в представление о физико-химической стабильности молекулы ДНК как основе стабильности генетического материала клеток. Ни в малой степени не умаляя значения этого фундаментального обобщения, революционизировавшего в свое время понимание природы генетического материала, необходимо, однако, отметить, что даже беглый обзор последующего изучения факторов, обуславливающих стабильность генетического материала, демонстрирует недостаточность такого представления.

1. ДНК нестабильна конформационно. Даже в отсутствие взаимодействия с белками она может принимать различные конформации, радикально отличающиеся от первоначально описанной В-конформации. При взаимодействии же с белками разнообразие ее конформаций пока трудно даже себе представить. Переход в альтернативные конформации определяется не только свойствами самой молекулы ДНК, но и взаимодействием с её окружением.
2. ДНК нестабильна химически. При нормальных физиологических условиях ее компоненты подвергаются химическим превращениям как спонтанным, так и вызванным взаимодействием с активными внутриклеточными метаболитами и факторами внешней среды. Поддержание стабильности на этом уровне определяется не столько физико-химической стабильностью молекул ДНК, сколько активностью специальных систем репарации.
3. ДНК нестабильна в процессе репликации. При копировании генетической информации в процессе синтеза ДНК требуется значительная точность. Чтобы не сделать ни одной ошибки при копировании генома человека требуется, чтобы частота ошибок не превышала одну на 3х10⁹ нуклеотидов. Если такая степень точности не будет достигнута, процесс перманентного накопления ошибок при каждом делении, в конце концов, сотрет всю генетическую информацию. Термодинамические оценки показывают, что за счет простого физического взаимодействия комплементарных пар нуклеотидов: аденозин-тимидин и гуанозин-цитидин, которые обуславливают физическую основу генетического кода, нельзя добиться точности более чем одна ошибка на 100 включенных нуклеотидов.
   Реализация более высокого уровня точности, необходимого для поддержания жизни сложных биологических систем, требует активности специальных корректирующих и репарирующих систем.
4. ДНК не является долговременно стабильной целостной молекулой.
   С высокой частотой различные фрагменты ДНК могут рекомбинировать, меняя свою локализацию в пределах хромосом или объединяясь в новые генетические конструкции. Активность специальных рекомбинационных систем может обуславливать перетасовку генов, осуществляющуюся с разной степенью эффективности у разных организмов, или регулировать активность определенных генов, как в случае переключения пола у дрожжей, или создавать новые варианты белковых молекул, как в случае генерации разнообразия узнающих молекул иммунной системы.
5. Химическая структура ДНК может меняться в процессе включения
   и выключения генов, как это происходит в процессе присоединения метильной группы в 5’-положении цитозина. Специфическая система метилирования принимает участие в регуляции активности генов и поддержании их в инактивированном состоянии.
6. Динамическая природа генетического материала ярко проявляется во взаимодействии ДНК с различными белковыми структурами и при укладке огромных молекул ДНК в хроматиновые структуры. В результате обеспечивается не только чрезвычайно плотная упаковка генетического материала в крайне ограниченном объеме клеточного ядра с сохранением возможности эффективного доступа различных высокомолекулярных белковых машин к любому участку ДНК, но и реализуется возможность оперативной реорганизации всей структуры ядра.

Сегодня становится все более очевидным, что генетический материал – это динамическая структура, стабильность которой активно поддерживается многообразными механизмами. Напротив, нестабильность – это не обязательно продукт физико-химической дестабилизации ДНК, она вполне может оказаться продуктом активности специализированных генетических машин клетки. Так, например, большинство классических мутаций дрозофилы, послуживших основой для становления генетики, оказалось результатом не просто повреждений в ДНК, а следствием интеграции в рассматриваемые гены мобильных генетических элементов, способных перемещаться в геноме. Таким образом, сталкиваясь с тем или иным проявлением нестабильности или динамической реорганизации генетического материала, мы не можем без специального исследования определить, каков его механизм и какие факторы обуславливают его проявление.
Направление, изучающее совокупность упомянутых феноменов и их взаимодействий, получило название «исследование динамической организации генома».
Несколько проявлений генетической нестабильности исследуются в ЛКБ.

1. Нами обнаружено, что подавление репаративного синтеза ДНК комбинацией ингибиторов приводит к накоплению в ДНК клеток млекопитающих однонитевых брешей. Если достаточно долго препятствовать репарации этих брешей, то они трансформируются в летальные для клетки события такие, как двунитевые разрывы (Filatov et al.,1998). Эти бреши могут возникать в процессе репарации последствий каких-то событий, нарушающих целостность ДНК. Однако природа этих событий остается загадкой. Ответ на этот вопрос можно получить лишь экспериментально.
   Трудность в том, что спонтанный уровень нестабильности генома в клетках млекопитающих очень низок и не регистрируется обычными методами.
   Предлагаемая нами система позволяет это сделать.

   Другая задача, которая может быть решена в рамках этого исследования – разработка нового подхода избирательной инактивации злокачественно трансформированных клеток, который может послужить основанием для создания нового варианта химиотерапии опухолей. Подавление спонтанного репаративного синтеза ДНК приводит к гибели обрабатываемых клеток.
   Наши исследования показали, что разные человеческие клетки обладают различной чувствительностью к такой обработке. Поскольку многие злокачественно-трансформированные клетки имеют повышенный уровень спонтанной нестабильности генома, можно ожидать, что они будут более чувствительны к определенной обработке. Предварительные клинические испытания схемы химиотерапии солидных опухолей поздних стадий, основанные на наших разработках, продемонстрировали, что она действительно может быть эффективна при незначительных побочных эффектах.

2. Второй проект исследования динамической организации генетического материала в клетках млекопитающих направлен на изучение судьбы чужеродной ДНК, случайно встроившейся в геном клеток млекопитающих. Известно, что введение в клетки млекопитающих экзогенной ДНК с достаточно высокой частотой (варьирующей от 1 на 10⁵ до 1 на 10² клеток при разных способах трансфекции) приводит к получению трансгенных клеточных линий. Учитывая тот факт, что как соматические, так и зародышевые клетки млекопитающих постоянно подвергаются воздействию значительных количеств чужеродной ДНК, можно было бы ожидать частое обнаружение в различных участках генома случайно интегрировавшейся лишней ДНК, такой, например, как бактериальной и вирусной. Однако реально сколь-либо значимого накопления чужеродной ДНК в клетках млекопитающих не наблюдается ни in vivo, ни in vitro.
   Наличие или отсутствие трансгенной ДНК в геноме подтверждалось с помощью метода ПЦР-анализа, что свидетельствует об удалении инородной ДНК из генома. Эти и другие наблюдения приводят к выводу о феномене избирательной потери чужеродной ДНК, встроившейся в геном клеток млекопитающих (Иванов и др., 2003).
3. Третий проект направлен на изучение последствий искусственного увеличения эффективности гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих.
   В отличие от дрожжей или бактерий клетки млекопитающих имеют слабую способность к спариванию и обмену гомологичных последовательностей между хромосомами или между хромосомной и экзогенной ДНК. Для повышения эффективности этого процесса мы встраивали в геном млекопитающих векторы, способные экспрессировать бактериальные рекомбиназы типа белка RecA. Оказалось, что такие рекомбиназы могут функционировать в геноме клеток млекопитающих и способны увеличивать частоту такого процесса гомологичной рекомбинацией, как нокаут генов, (Shcherbakova et al., 2000).
4. Четвертое направление исследований – это проверка утверждения, что снятие ограничений на изменчивость лежит в основе опухолевой прогрессии.

   В последние 15 лет происходит смена концептуального взгляда на природу злокачественного перерождения клеток и факторов, способствующих прогрессии онкологических заболеваний. Становится очевидным, что в основе возникновения и прогрессии злокачественных новообразований может лежать снятие присущих нормальным клеткам многоклеточных организмов ограничений на изменчивость генетического материала.
   Результатом этого являются различные нарушения взаимодействия клетки и организма, включающие и нарушения регуляции клеточного цикла.
   Накопление таких изменений приводит к возникновению вариантов клеток, способных обходить ограничения, накладываемые на их размножение различными клеточными, тканевыми и организменными факторами, а также различными видами терапевтических воздействий. Таким образом, изменчивость генетического материала злокачественно трансформированных клеток является ключевым событием в онкогенезе.

   На современном уровне знаний изменчивость генома клеток может быть обеспечена несколькими путями.

   1. Могут происходить мутационные изменения, включающие в себя замены отдельных нуклеотидов (букв, которыми записан генетический код), а также небольшие, длиною в несколько нуклеотидов, вставки и потери (делеции) фрагментов ДНК.
   2. При блочных перестройках наблюдается существенная перетасовка больших фрагментов генома, сопровождающаяся даже переходом фрагментов одних хромосом на другие. В случае таких изменений включается специальная программа самоуничтожения, так называемой программируемой гибели клетки или апоптоза. Работа этой программы в значительной степени определяется системой генов, ключевым из которых является ген, кодирующий транскрипционный фактор р53. Следовательно, злокачественное перерождение потребует от клетки сломать или отключить эту систему надзора за её изменчивостью.
   3. Экспрессия или неэкспрессия гена может регулироваться с помощью метилирования (присоединения метильной группы к цитозинам, находящимся в регуляторных участках гена). В некоторых опухолях такое метилирование, существенное для роста опухоли, может быть изменено, что влечет за собой нарушение работы генов даже в отсутствие перестроек и нарушений генетического материала. Механизмы, ограничивающие такое изменение экспрессии в нормальных клетках, пока остаются загадкой.
   4. Хотя вирусная теория происхождения рака себя не оправдала, тем не менее, участие вирусов в процессах канцерогенеза (злокачественной трансформации клеток) и онкогенеза (процесса развития опухоли) в целом ряде случаев не вызывает сомнения. Этот список включает сегодня: вирус Эпштейн-Барр, вирус Т-клеточной лейкемии человека, вирусы гепатита В и С, герпесный вирус ННV-8, вирусы папилломы 16,18,45,56 и 31 и, вероятно, полиомный вирус JC. Этот список постоянно расширяется.

   Подводя итог, можно заключить, что приобретение способности к генетической изменчивости, которое неизбежно сопровождает злокачественное перерождение клеток, может происходить несколькими путями. Однако результат этих событий сходен. С большой частотой в клетках начинают происходить случайные генетические изменения, в результате чего возникают клоны с различными ростовыми свойствами. Далее происходит отбор клонов, способных лучше расти в данных конкретных условиях. Происходит как бы эволюция опухоли, совершенствующей со временем свои ростовые свойства. Если рост опухоли встречается с препятствиями либо накладываемыми организмом, либо вызванными теми или иными видами терапии, то дальнейшая прогрессия опухоли будет зависеть от того, могут ли в ней возникнуть варианты клеток, способные преодолеть эти ограничения.

Любые концептуальные воззрения значимы лишь в том случае, если они способны дать практические следствия. Следствием сказанного, как нам представляется, являются три момента, существенные для стратегии лечения злокачественных новообразований.

1. Так как злокачественное перерождение клетки и ее адаптация к аномальному росту в организме происходит в результате случайных нарушений (поломок) отдельных элементов (генов) в хорошо отлаженной (скоррелированной) машине – клетке, то, несомненно, оно должно сопровождаться издержками, не позволяющими опухолевой клетке любой опухоли обязательно должны иметь свои слабые места, которые могут быть точками приложения терапии. Кажется уместной следующая аналогия: с помощью случайных ударов и повреждений можно заставить хронометр идти быстрее, но это ни в коем случае не означает, что он станет лучше. Он почти наверняка остановится, если его положить на другой бок, вопрос только в том, на какой бок его при этом нужно положить.
2. Поскольку изменения, приводящие к канцерогенезу, относительно случайны и происходят среди большого набора генов, которые могут принимать участие в формировании опухолей, то возникающие опухоли даже сходного гистогенеза, не являются абсолютно одинаковыми и могут существенно различаться по чувствительности к тому или иному виду терапии. В известном смысле можно говорить об индивидуальности каждого случая онкологического заболевания, характеризующегося своим специфическим набором измененных онкогенов и антионкогенов, обеспечивающих прогрессию опухоли.
   Оптимальным было бы выявление слабых мест конкретной опухоли и подбор адекватных терапевтических приемов. Яркой иллюстрацией этого положения является метаболическая зависимость ряда опухолей от наличия определенных аминокислот (таких, например, как аспарагин, глютамин или метионин). Голодание по этим аминокислотам может приводить, как минимум, к торможению роста соответствующих опухолей. Такая же проблема, видимо, связана с попытками сдерживать рост опухолей с помощью диеты.

   По существу, универсальная проблема лечения злокачественных новообразований заключается в отсутствии универсальных рецептов.
   Так как на сегодняшний день мы не в состоянии в каждом случае определить особенности данной опухоли и предложить адекватную для ее лечения терапию, то оптимальной стратегией достижения успеха представляется комплексное использование всего имеющегося набора терапевтических приемов. В этом аспекте становится особенно важным развитие терапевтических подходов, которые сравнительно легко переносятся больными и не исключают использование других форм терапии. Такую возможность, несомненно, могут дать различные виды иммунотерапии.

3. Известно, что изменчивость опухолевых клеток ведет к появлению вариантов клеток, устойчивых к используемому варианту терапии уже в ходе последней. Преодоление этого препятствия снова приводит нас к необходимости комплексных подходов в терапии опухолей, предполагающих параллельное использование различных способов подавления опухолевой прогрессии.

Таким образом, расширение имеющегося арсенала методов терапии является крайне актуальной задачей. Исследование механизмов, приводящих к увеличению нестабильности генетического материала опухолевых клеток и их проявлений на клеточном и тканевом уровнях, может позволить решить эту задачу.