(располагается в ПИЯФ РАН)
Исаев-Иванов В.В., к.ф.-м.н., c.н.с.
научн. сотр. Лебедев Д.В., к.ф.-м.н.
научн. сотр. Денисов Ю.Ю., к.ф.-м.н.
лаборант Усов Д.В., студент СПбГТУ

Научные интересы группы лежат в области экспериментального изучения структуры и динамики молекулярных и надмолекулярных биологических комплексов оптическими, магнитно-резонансными методами и с использованием техники рассеяния нейтронов. Кроме того, в текущем году в связи с приобретением прибора начинается освоение техники атомной силовой микроскопии в ее сканирующем варианте. Работы по упругому и квазиупругому рассеянию нейтронов проводятся в сотрудничестве с Объединенным институтом ядерной физики в Дубне и путем получения на конкурсной основе времени на экспериментальных установках в Институте нейтронного рассеяния в Научном центре в Юлихе (ФРГ) и в Институте Лауэ-Ланже-вена в Гренобле (Франция).

Группа работает в тесном сотрудничестве c лабораториями молекулярной генетики и клеточной биологии ОМРБ ПИЯФ.

В настоящее время группа участвует в двух проектах, которые поддержаны грантом РФФИ и Программой РАН “Физика элементарных частиц” по направлению “Исследование структуры, динамики и неординарных свойств вещества нейтронными методами”.

Сравнительное изучение структуры и динамики рекомбиназ RecA дикого и мутантного типа и RadA из Archaea при их взаимодействии с нуклеотидными кофакторами

Работа по этому проекту ведется в тесном сотрудничестве с лабораторий молекулярной генетики ОМРБ ПИЯФ. Проект направлен на решение фундаментальной проблемы, связанной с изучением роли структурной гомологии и молекулярной динамики бактериальных белков RecA и структурно-функциональных характеристик RecA/RadA –подобных белков царства Bacteria и Archaea, определяющих такие фундаментальные механизмы клетки, как гомологическая рекомбинация, репарация и радиорезистентность.

В рамках этого проекта был разработан метод и создано программное обеспечение для разделения спектров эмиссии и возбуждения флюоресценции белков на спектры эмиссии и возбуждения их тирозиновой и триптофановой составляющих. Этот метод может быть применен практически для любых белков. Мы использовали разработанный метод для изучения белка RecA из E.coli при его взаимодействии с нуклеотидными кофакторами и однонитевой ДНК. Природная особенность белка RecAEc состоит в том, что его тирозиновая флюоресценция обусловлена тирозино-выми остатками основного домена, в котором расположен центр связывания с ADP или ATPyS, а триптофановая - триптофановыми остатками С-концевого домена. Как показано в нашей работе, гашение флюоресценции триптофановых остатков при взаимодействии белка RecAEc с ADP (или AT PуS) является негомогенным. В предположении, что это гашение обусловлено переносом энергии с триптофановых остатков на аденин ADP или AT PуS, (но не с низших вибрационных уровней возбужденного состояния, а с более высоких), мы показали, что для расчета интеграла перекрытия необходимо использовать спектр поглощения ADP или ATPyS и функцию, которая является сверткой спектров эмиссии и поглощения триптофановых остатков. Это позволило нам объяснить экспериментальное увеличение эффективности гашения триптофановых остатков при переходе от комплекса белка RecAEc с ADP к комплексу с ATPyS изменением в протомере белка взаимного положения С-концевого домена, содержащего триптофановые остатки, и основного домена, содержащего место посадки аденина.

В рамках этого проекта методами упругого и квазиупругого рассеяния нейтронов проводится систематическое исследование структурно-динамических параметров в ряду RecA/Rad51/RadA-подобных белков, что позволяет найти как структурные корреляции, объясняющие консервативность этих рекомбиназ, так и корреляцию между функциональными различиями и молекулярной динамикой этого ряда белков. Нами впервые в общем виде была решена прямая задача для метода малоуглового рентгеновского и нейтронного рассеяния на периодических структурах в растворе, дающая аналитическую связь между интенсивностью рассеяния, периодом структуры и форм-фактором повторяющегося элемента структуры. Из общего решения, в приближении первого дифракционного максимума и в предположении о равномерном распределении плотности рассеивающего вещества по сечению спирали, получено решение прямой задачи для метода малоуглового рассеяния нейтронов на спиральных филаментных структурах, образуемых RecA и RecA-подобными белками и их нуклеопротеидны-ми комплексами, дающее аналитическую связь между интенсивностью рассеяния и средним диаметром спирали, ее шагом и радиусом мономера, образующего спираль. На основе полученного аналитического решения прямой задачи создано программное обеспечение, позволяющее решать обратную задачу малоуглового рассеяния нейтронов на спиральных филаментных структурах - путем подгоночной минимизационной процедуры получать из экспериментальных кривых малоуглового рассеяния нейтронов средний диаметр спирали, ее шаг и радиус мономера, то есть те параметры, которые полностью определяют структуру спирального филамента. Было проведено сравнительное измерение параметров спиральных фила-ментов бактериальных белков RecA из Е. coli и Ps. aeruginosa при их взаимодействии с нуклеотидными кофакторами (Рис). В результате было показано, что структура филаментов, которые образуют эти белки в составе тройного (RecA::Mg²⁺::ATPyS) и предсинаптического четверного (RecA::Mg²⁺: ATPyS::ssDNA) комплексов, обладает высокой степенью консервативности. Параметры спиральной структуры - средний диаметр спирали, ее шаг и радиус мономера белка в составе указанных комплексов, совпадают для этих белков с точностью до ошибки эксперимента.

В текущем году в Институте нейтронного рассеяния в Научном центре в Юлихе (ФРГ) на установке нейтронного спин-эхо нами впервые были выполнены пилотные измерения на белках RecA из E. coli и Ps. aeruginosa. В настоящее время ведется обработка полученных данных.

Изучение упаковки ДНК в ядрах клеток высших

Работа по этому проекту ведется в тесном сотрудничестве с лабораторий клеточной биологии ОМРБ ПИЯФ. Проект направлен на изучение методом рассеяния нейтронов корреляции между структурной иерархией в упаковке ДНК в ядрах клеток высших и ее функционально значимым нарушением при патологическом состоянии клеток.

Одним из важнейших достижений последних десяти – пятнадцати лет в науке о молекулярных основах жизни является определение нуклеотидных последовательностей полных геномов. Причем это относится ко всем трем царствам живого: прокариотам, архаем и эукариотам, включая человека. Наличие этих полных нуклеотидных текстов геномов позволяет использовать весь арсенал существующих математических методов для анализа этих последовательностей как целого.

Одним из результатов такого анализа стало обнаружение “long-range correlation” в исследуемых нуклеотидных последовательностях [1], которые характерны для фрактальных объектов и процессов. В последнее время проявление этих фрактальных свойств удалось установить в нуклеотидных последовательностях ДНК многих геномов из всех трех царств живого [2,3]. Такой анализ позволяет авторам этих работ строить модели и спекулятивные гипотезы организации хроматина у высших, которые могли бы объяснить биологическую значимость наблюдаемых корреляций.

Так как наблюдаемые корреляции характерны для очень длинных последовательностей ДНК, то можно предполагать, что проявляться эти корреляции должны в высших порядках упаковки хроматина. Однако, хотя принципы упаковки ДНК в ядрах высших и структура хроматина являются предметом интенсивных исследований, только нуклеосомная структура упаковки ДНК [4] является общепризнанной. Следующий уровень организации хроматина – образование 30нм-фибрилл до последнего времени оставался спорным. Только в последние годы, благодаря ряду работ [5,6], структура иррегулярной упаковки нуклеосом типа “зиг-заг” получила убедительное экспериментальное подтверждение. Что касается структуры более высоких порядков упаковки хроматина в ядрах высших, то это по-прежнему предмет научных исследований и дискуссий.

С другой стороны, возможна и иная постановка задачи. Если в построении нуклеотидных “текстов” прослеживаются фрактальные свойства, то возникает вопрос, не обладает ли трехмерная структура хроматина и упаковка ДНК в ней признаками фрактала? Ответ на этот вопрос можно получить, не имея точных знаний о структуре хроматина. Таким экспериментальным подходом, который может дать ответ на этот вопрос является метод малоуглового рассеяния либо света, либо рентгеновских лучей, либо нейтронов. Известно [7], что зависимость интенсивности рассеяния от переданного волнового вектора, представленная в двойных логарифмических координатах, может прямо ответить на поставленный вопрос. При этом, если эта зависимость линеаризуется и структура обладает свойствами, например, масс-фрактала, то определяется и размерность такого фрактала.

Из перечисленных рассеиваемых частиц преимуществом обладают нейтроны. Их способность изменять контраст при замене обычной воды на тяжелую потенциально позволяет отделить вклады белковой компоненты хромосомной структуры от ДНК. Второе преимущество малоуглового рассеяния нейтронов перед другими лучами состоит в том, что существующие современные спектрометры малоуглового рассеяния нейтронов, позволяют проводить измерения интенсивности рассеяния в диапазоне переданных векторов от ~ 5•10^-1 A^-1 до 7•10^-5 A^-1, что соответствует линейным размерам рассеиваемых структур, от ~ 10 A до 10 мкм, а это перекрывает диапазон хромосомных структур от нуклеосом до размеров ядра как целого.

Для ответа на поставленный нами вопрос были проведены измерения малоуглового рассеяния нейтронов на тандеме спектрометров KWS-2 и KWS-3, расположенных на реакторе FRJ-2 в Институте нейтронного рассеяния в Научном центре в Юлихе (ФРГ). При этом удалось перекрыть диапазон переданных векторов от 10^-1 A^-1 до 10^-4 A^-1, что соответствует размерам структур от нуклеосомной до размеров целого ядра. Кроме того, были проведены измерения с вариацией контраста, что позволило разделить малоугловое рассеяние нейтронов для белковой компоненты хроматина ядер и для ДНК.

Предварительные результаты позволяют предположить, что структура хроматина, начиная с нуклеосомных размеров, обладает признаками масс-фрактала. Причем фрактальные размерности белковой компоненты и ДНК в составе хроматина имеют разную величину.