Постоянно работают в Центре:

c.н.с. Петухов М.Г., к.ф.-м.н., ПИЯФ РАН
м.н.с. Рычков Г.Н., к.ф.-м.н, ПИЯФ РАН

Наша группа в сотрудничестве с лабораторией молекулярной генетики ОМРБ, а также с несколькими зарубежными лабораториями (EMBL, Heidelberg, Germany и ONRI, Osaka, Japan) развивает как фундаментальные, так и прикладные исследования в нескольких современных направлениях молекулярного моделирования биомакромолекул.

Исследование причин экстремальной термостабильности белков на примере суперсемейства белков RecA

К настоящему времени известны аминокислотные последовательности нескольких десятков белков RecA из различных бактерий и 14 белков RecA из архебактерий. Кроме того, было получено несколько пространственных структур микробных белков RecA. Взяв за основу классическую структуру белка RecA из E.coli и используя высокую гомологичность первичных последовательностей суперсемейства белков RecA, мы реконструировали аминокислотные последовательности α-спиралей 31 белка RecA, принадлежащих различным таксономическим группам. Проведенный нами анализ энергетических характеристик α-спиралей белков RecA показал, что стабильные α-спирали являются необходимым условием термостабильности белков этого семейства. Однако наличие высоких показателей α-спиральной стабильности у некоторых белков RecA из мезофильных организмов, в том числе и E.coli, показало, что это условие не является достаточным. Наряду с α-спиралями, другие элементы вторичной структуры (Р-структуры, повороты и др.), а также третичные взаимодействия между ними влияют на стабильность белков RecA при повышенных температурах.

Другим важным результатом данной работы явилось то, что для нормального функционирования белков RecA при данных внешних условиях (температура, pH, соль) их структура должна иметь близкую к оптимальной жесткость белковой структуры и, в частности, их а-спиралей. Это свойство белка может быть количественно охарактеризовано величиной изменения свободной энергии свертки а-спиралей белка. Как было нами показано, три класса белков RecA (из психротрофов, мезофилов и термофилов) реализуют оптимальную жесткость своей структуры при нормальных для них физиологических температурах 20, 37 и 74^oС соответственно.

Эти результаты были уточнены и обобщены на другие классы белков в работе, опубликованной в журнале Proteins (Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their alpha-helices, Petukhov, Michael, Kil Yuri, Kuramitsu Seiki, and Lanzov Vladislav , Proteins, Volume 29, Issue 3, p.309-320, (1997) ). Кроме того, мы представили в этой работе оптимизированные аминокислотные последовательности а-спиралей белков RecA, которые, согласно теоретическим расчетам, должны обладать близкой к оптимальной жесткостью при температурах около 200°С. Эта работа получила высокую оценку специалистов в данной области. В частности, известный обзорный журнал Current Opinions in Biotechnolgy присвоил этой работе свой высший ранг (**), как одному из выдающихся материалов, опубликованных в 1997 году.

Исследование факторов, влияющих на стабильность α-спиралей в белках

В данной серии работ экспериментально и теоретически исследовались различные способы, позволяющие стабилизировать α-спирали коротких пептидов и небольших водорастворимых глобулярных белков. Было найдено несколько новых факторов, значительно понижающих энергию α-спиральных участков белков, и в частности, три новых фактора в N-мотивах так называемого “capping box”:

1. дополнительная водородная связь для Ser, Thr и Cys в позиции Ncap и основной цепью белка;
2. электростатические взаимодействия между заряженными остатками в позициях Ncap и N4;
3. возможные водородные связи между донорами α-аминогрупп и акцепторами в позиции N4.

Кроме того, было показано, что аминокислоты при трех N- и трех С-концевых положениях белковых α-спиралей имеют существенно отличные энергетические характеристики по сравнению с их центральными положениями. Позиционные изменения свободной энергии неполярных, полярных незаряженных аминокислот и глицина при N- и С-концевых положениях были экспериментально получены с помощью CD-измерений на наборе специально сконструированных синтетических пептидов. Методами молекулярного моделирования было показано, что эффект имеет сложную природу и состоит из комбинации достаточно небольших энергетических вкладов различной природы (невалентные взаимодействия, энтропийные эффекты и изменения условий гидратации), которые и определяют знак и величину позиционного эффекта для каждой природной аминокислоты. Учет данного эффекта в статистико-механических моделях, описывающих переходы спираль – клубок в белках, позволил значительно улучшить корреляцию предсказаний этих моделей с экспериментальными данными для широкого круга исследуемых пептидов и белков. Учитывая, что данный эффект распространяется на шесть аминокислот каждой α-спирали (три N- и три С-концевых положения), суммарная энергия дополнительной стабилизации для некоторых аминокислотных последовательностей может достигать величины в несколько ккал/моль.

Полученные результаты имеют большое значение не только для понимания энергетики функционирования белков, но и для практических целей рационального конструирования белков с заданными свойствами в биотехнологических приложениях. В частности, нами был создан уникальный вычислительный метод глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей α-спиралей коротких пептидов и белков.

Моделирование гидратации белков

Гидратация белков – это один из основных факторов, влияющих на свёртку белков в нативную третичную конформацию. В этой серии работ мы разрабатываем новую модель гидратации белков, основанную на расчетах поверхности белка доступной растворителю (ПДР). В отличие от других потенциалов гидратации, использующих ПДР, данная модель гидратации белков содержит все основные физические вклады в свободную энергию гидратации и включает:

1. явный учёт водородных связей между белком и водой;
2. электростатическую поляризацию растворителя, рассчитанную с использованием модифицированной модели аппроксимации образов зарядов;
3. энтропийные эффекты, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и вклад, обусловленный созданием полости внутри растворителя, который вычисляется с использованием традиционных атомарных параметров гидратации (АПГ).

Свободная энергия образования водородных связей с водой рассчитывается на основе статистических данных по водородным связям, полученных из моделирования молекулярной динамики нескольких пептидов и глобулярных белков в периодических водных боксах. Модель также явно учитывает наличие всех возможных водных мостиков с белком, как это было предложено недавно в опубликованной нами работе. Предсказания, сделанные на основе данной модели, находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными. Данная модель совмещает в себе высокую скорость вычислений потенциалов на основе ПДР с высоким разрешением других более сложных моделей гидратации. Кроме того, в совместной работе лабораторией оптики полупроводников ФТИ РАН с помощью методов Рамановской спектроскопии нам впервые удалось экспериментально обнаружить существование водных мостиков на поверхности лизоцима белка куриных яиц.