зав. лаб. Королев В.Г., д.б.н.

Состав лаборатории:
с.н.с. – 7, н.с. – 7, м.н.с. – 1,
ст. лаб. – 7, студ.-лаб.– 1.

Постоянно работают в Центре:
с.н.с. Кожина Т.Н., к.б.н.
ст. лаб. Проворова Е.Е.

ЛГЭ развивает как фундаментальные, так и прикладные исследования.
Первые включают следующие проекты.

1. Изучение молекулярных основ рекомбинационной репарации у эукариот.
   Отв. исп.: Пешехонов В.Т. и Чепурная О.В.
2. Изучение репарационных процессов у многоклеточных организмов (дрозофила).
   Отв. исп.: Хромых Ю.М., Саранцева С.В., Варенцова Е.Р., Котлованова Л.В.
3. Изучение молекулярных механизмов репарации поврежденных оснований ДНК.
   Отв. исп.: Кожина Т.Н., Латыпов В.Ф.
4. Генетический контроль мутагенеза у дрожжей (репарация неспаренных оснований ДНК,адаптивный мутагенез, УФ-индуцированный мутагенез).
   Отв. исп.: Грачева Л.М., Федорова И.В., Ковальцова С.В., Евстюхина Т.А. и Кельберг Е.П.
5. Молекулярная палеобиология, изучение микрофлоры подо льдами Антарктиды.
   Отв. исп.: Булат С.А., Алехина И.А.

Изучение молекулярных механизмов репарации поврежденных оснований ДНК

Первоначальной задачей настоящего исследования было получение новых мутантов, затрагивающих такую ветвь эксцизионной репарации, как BER - эксцизионная репарация оснований. Это было связано с недостаточной изученностью этого процесса по сравнению с NER-нуклеотидной эксцизионной репарацией. Достаточно отметить, что система BER начала исследоваться приблизительно на 10 лет позже чем NER, при этом работы проводились гораздо меньшим количеством лабораторий и в основном на Escherichia coli.

У дрожжей эта проблема стала исследоваться в начале 70-х годов, но ее интенсивное изучение следует отнести к началу 90-х . За последнее время интерес к изучению BER многократно возрос, результатом чего явилось обнаружение у дрожжей ряда ферментов, осуществляющих различные этапы BER: N-гликозилазы, АП-эндонуклеазы, ДНК- полимераза и лигаза. Тем не менее, механизм и генетический контроль многих участников этого процесса изучен недостаточно.

В связи с поставленной задачей была разработана оригинальная система получения мутантов с нарушенной репарационной способностью.
В основе ее лежал УФ-мутагенез штамма, несущего мутацию в гене RAD2, то есть с выключенной системой NER, которая играет определяющую роль в репарации УФ-индуцированных повреждений. Предполагалось, что возникновение дополнительных мутаций в генах BER или другой системе репарации будет приводить к повышению чувствительности исходного штамма к летальному действию УФ-лучей. Такая коллекция мутантов была получена в ЛГЭ ПИЯФ в 1994 году.

Из 20 изолированных мутантов, имеющих более высокую, чем исходный штамм, чувствительность к летальному действию УФ-лучей, 9 оказались одновременно и ММС-чувствительными. Эти мутанты и являются предметом исследований данной группы

Один из изучаемых генов был обозначен как X64, но впоследствии, согласно международной номенклатуре, получил название RAD29.
Генетический анализ показал, что мутация RAD29-64 определяет плейотропный фенотип: слабую чувствительность к летальному действию УФ – лучей и метил-метансульфонату (ММС) и высокую чувствительность к азотистой кислоте. Мутация RAD29-64 была картирована с помощью методов хромосомной дестабилизации и тетрадного анализа в правом плече хромосомы II между CENII и кластером PHO3- PHO5.

Успешной оказалась работа по клонированию и физическому картированию данного гена. Показано, что ген RAD29 идентичен гену RDH54.
Мутант RAD29-64 был изолирован в лаборатории генетики эукариот ПИЯФ в 1994 году и работа по его изучению происходила независимо. На основании изучения генетических мутантов по гену RAD29/RDH54 сделан вывод, что его продукт работает в эксцизионной репарации оснований.

Второй наиболее изученный мутант гена Х237 показал широкий плеотропный фенотип, который выражался в чувствительности к широкому спектру химических и физических агентов, вызывающих различные типы повреждений ДНК. Он был также клонирован, физически картирован и оказался аллелью гена CTF4. Генетический анализ показал, что данный ген вовлечен преимущественно в контроль репарации окисленных оснований.

Полученные в данных исследованиях результаты позволяют предполагать наличие в дрожжах двух ветвей репарации поврежденных оснований. Одна ветвь связана с репарацией алкилированных оснований и контролируется генами RAD29, APN1, RAD27 и DNA2. Вторая ветвь контролируется генами APN2, CTF4 и, возможно, другими неизвестными генами. Доказательство этого предположения и является предметом исследования даанной группы.

Изучение молекулярных основ рекомбинационной репарации у эукариот

Субстратом для этой репарации являются двунитевые разрывы (ДНР) в ДНК и, возможно, однонитевые (ОН) бреши напротив некодирующих повреждений ДНК. Вызванные псораленом сшивки цепей ДНК также репарируются с помощью рекомбинационной репарации. Поврежденная ДНК может вступать в рекомбинацию как с гомологичной хромосомой, так и с сестринской хроматидой (в фазе G2); последний процесс более эффективен. Рекомбинация между сестринскими хроматидами может происходить и непосредственно в фазе S как альтернативный механизм обхода некодирующих повреждений ДНК.

Все мутанты по генам этой группы чувствительны к ионизирующей радиации и ММС. Ряд из них (rad50, rad51, rad52, rad59 и xrs2) также чувствителен к УФ-облучению, и у всех мутантов группы RAD52 нарушена митотическая и/или мейотическая рекомбинация так, что ни один из них не является специфически репарационным. Это не удивительно, так как ДНР являются нормальными интермедиатами процессов рекомбинации. Функции большинства генов этой группы в митотической и мейотической рекомбинации известны. В связи с этим мы сконцентрировали внимание на генах, контролирующих минорные ветви рекомбинационной репарации.
В частности, нас интересовал генетический контроль межсестринской и межхромосомной рекомбинации. С использованием оригинальной методики отбора мутантов, нами была получена коллекция мутантов дрожжей с нарушенной межхромосомной рекомбинацией. Мутанты по генам REC41, REC42, MMS1 были подробно изучены. Показано, что они чувствительны к ионизирующему излучению только в диплоидном состоянии, у них понижена частота индуцированного кроссинговера. Ген REC41 был клонирован и физически картирован. Показано, что он контролирует гликозилтрансферазу, которая, по-видимому, участвует в модификации транскрипционного фактора, регулирующего экспрессию рекомбинационных генов. Функции двух последних генов пока не выяснены и являются предметом настоящих исследований. Проводится работа по расширению коллекции мутантов по генам, контролирующим межхромосомную рекомбинацию.

Изучение генетического контроля мутагенеза у дрожжей

Клетки обладают механизмами. позволяющими с высокой точностью переносить генетический материал из генерации в генерацию. С другой стороны, все организмы имеют определенный уровень возникновения спонтанных мутаций, что является следствием как высокой точности самого процесса репликации, так и эффективной работы репарационных систем. Таким образом, уровень спонтанного мутагенеза находится под генетическим контролем и определяется, с одной стороны, ошибками репликации и, с другой, ошибочной репарацией спонтанных повреждений ДНК. Ошибки репликации ДНК репарируются специализированными системами коррекции ошибочно спаренных оснований (ОСО). Существуют, по крайней мере, три пути, по которым ОСО возникают в ДНК. Во-первых, физические повреждения ДНК. Например, образование 5-метилцитозина в результате метилирования ДНК может приводить к появлению на его месте тимина за счет редких событий спонтанного дезаминирования этого основания, что, в свою очередь, обусловливает возникновение ошибочной пары G:T. Во-вторых, ошибочное спаривание нуклеотидов в ходе репликации ДНК может приводить к образованию ОСО, а также инсерций и делеций нуклеотидов. Наконец, генетическая рекомбинация образует области гетеродуплексной ДНК, которые могут содержать ОСО из-за спаривания двух различных родительских последовательностей ДНК. ОСО, возникающие этими тремя путями, репарируются специализированными ферментативными системами.

В настоящее время наиболее полно молекулярные механизмы коррекции ОСО изучены на примере клеток кишечной палочки E. coli, у которой открыты два частично перекрывающихся пути репарации ОСО. С другой стороны, изучение процессов коррекции ОСО у эукариот находится на начальных стадиях. Показано, что клетки эукариот обладают более сложными и многоферментными системами коррекции ОСО. Однако более или менее ясной представляется только одна из первых стадий мажорной ветви процесса коррекции ОСО, а именно связывание последних опознающими ферментными комплексами. В связи с этим возникает целый ряд вопросов, среди которых основным является вопрос о количестве независимых путей репарации ОСО у эукариот. Важным является также вопрос генетического контроля процессов репарации ОСО у эукариот.

Ответ на эти вопросы может дать исследование процессов коррекции ОСО на простой эукариотической модели – дрожжах.

К настоящему времени мы показали:

1. в дрожжах существует минорный путь репарации ОСО;
2. этот путь контролируется генами HSM2, HSM3, HSM6, HIM1;
   двойные мутанты по этим генам по фенотипу не отличаются от одиночных мутантов.
3. все эти гены контролируют также УФ-индуцированный мутагенез;
   мутанты по ним не увеличивают чувствительность клеток к летальному действию мутагенов, но резко увеличивают частоту индуцированных мутаций;
4. предполагается, что продукты некоторых из этих генов могут образовывать белковые комплексы, которые способны опознавать ОСО в ДНК и способствовать их репарации.

Исследование возможного физического взаимодействия белковых продуктов изучаемых генов, а также поиск субстратов, с которыми могут связываться эти белки или их комплексы, поможет расшифровать механизм минорного пути репарации ОСО у дрожжей.