зав. лаб. Ланцов В.А., д.б.н., проф.

Состав лаборатории:
с.н.с. – 6, н.с. – 4, м.н.с. – 2, ст. лаб. – 3, студ. – 4.

Постоянно работают в Центре:
с.н.с. Байтин Д.М., к.б.н.
Виноградская Г.Р., кбн, снс
Вострюхина О.А., кхн
Киль Ю.В.
н.с. Глазунов Е.А., к.б.н.
Каганский А.М.
м.н.с. Червякова Д.Б.
Штам Т.А.
ст. лаб. Егорова А.А.
студенты Дудкина А.В.
Емельянова С.С.
Скориченко Е.А.
Тимофеев А.В.

ЛМГ развивает как фундаментальные, так и прикладные исследования.
Первые включают следующие проекты.

1. Изучение молекулярных основ генетической рекомбинации у прокариот: гиперрекомбинация.
   Отв. исп.: Байтин Д.М. и Бахланова И.В.
2. Сравнительный функциональный анализ главного фермента гомологической рекомбинации в трех доменах живого:
   1. Bacteria
      Отв. исп.: Байтин Д.М., Бахланова И.В. и Червякова Д.Б.
   2. Archaea
      Отв. исп.: Киль Ю.В., Глазунов Е.А.
   3. Eukarya
      Отв. исп.: Шалгуев В.И., Kaбоев О.К, Глазунов Е.А. и Киль Ю.В.
3. Изучение связи процессов когезии сестринских хроматид и различных путей репарации ДНК.
   Отв. исп.: Каганский А.М., Юрченко Л.В.
4. Канцерогенез: aнализ профиля генетических повреждений при развитии рака желудочно-кишечного тракта; наследственные и спонтанные повреждения системы коррекции неспаренных оснований ДНК.
   Отв. исп.: Вострюхина О.А., Штам Т.А.

Исследования проводятся совместно с НИИ онкологии им. проф. Петрова Н.Н. МЗ РФ.
К прикладным исследованиям относятся:

1. ПЦР-диагностика генетических путей развития рака желудочнокишечного тракта.
   Отв. исп.: Вострюхина О.А., Штам Т.А.
   Исследования проводятся совместно с НИИ онкологии им. проф. Петрова Н.Н. МЗ РФ.
2. ПЦР-диагностика опасных бактериальных и вирусных инфекций.
   1. Туберкулез
      Отв. исп.: Вострюхина О.А.
      Исследования проводятся совместно с Отделением туберкулеза легких у детей НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ и кафедрой туберкулеза Педиатрической академии МЗ РФ.
   2. Цитомегаловирус
      Отв. исп.: Виноградская Г.Р.
      Исследования проводятся совместно с кафедрой гематологии, трансфузиологии и трансплантологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова

Изучение молекулярных основ генетической рекомбинации у прокариот: гиперрекомбинация

Гомологичная рекомбинация (ГР) – обмен фрагментами между гомологичными молекулами ДНК с образованием гибридной структуры. ГР привлекается клеткой в критической ситуации, т.к. она способна использовать целостную гомологичную молекулу для репарации летальных для клетки двунитевых разрывов в поврежденной молекуле ДНК. Главным ферментом ГР является белок RecA, гомологи которого найдены повсеместно. Наши знания об этих рекомбиназах основаны на генетических, биохимических и структурно-функциональных исследованиях бактериального белка RecA из E. coli. Этот белок имеет два сайта связывания с ДНК. Первый служит для полимеризации белка на однонитевой ДНК (онДНК), что приводит его в рекомбинационно-активное состояние; второй связывает двунитевую ДНК, участвует в отыскании гомологии, спаривании и переброске одной из нитей на первый сайт, где и возникает продукт рекомбинации – гибридная ДНК.
Сравнительно низкая частота ГР определяется балансом сродства к онДНК у двух ДНК-связующих белков, SSB и RecA. Нарушение этого баланса в пользу RecA приводит к гиперрекомбинации.

Возникает вопрос, насколько гиперрекомбинация опасна для про- и эукариотической клетки, включая и клетки человека? В последних ГР многократно подавлена из-за многочисленных повторов в геноме, рекомбинация между которыми могла бы дестабилизировать его структуру. Вместе с тем, в отличие от прокариот, где основную роль играет RecA и ограниченное количество белков-помощников, в эукариотах, включая человека, действуют сложные специализированные белковые комплексы с участием RecAподобного белка Rad51, которые увеличивают мишень для повреждения рекомбинации в сторону ее гипо- или гиперактивности, что, в конечном счете, может дестабилизировать геном и вызвать озлокачествление клетки.

У бактерий, на первый взгляд, ситуация проще, но не менее загадочна.
При остановке синтеза ДНК в результате повреждения ДНК возникает SOS-ответ клетки, спасающий ее за счет потери точности воспроизведения ДНК. SOS-ответ сопряжен с гиперрекомбинацией и гиперрадиорезистентностью; последнее показывает уникальный феномен биокристаллизации белка RecA вокруг ДНК при повышенной радиации. Наконец, такой человеческий патоген, как синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa, обладает белком RecA c гиперактивностью. Случайно ли это? Где та мера гиперрекомбиногенности, которая усиливает репарацию (столь необходимую патогену в неблагоприятном окружении), но не приводит к дестабилизации генома и гибели клетки? Ответ на эти вопросы может дать исследование молекулярных основ гиперрекомбинации на простой бактериальной модели.

К настоящему времени мы показали:

1. Три события контролируют гиперрекомбинацию у бактерий: индукция SOS-функций, подавление системы коррекции неспаренных
   оснований в ДНК и изменение свойств белка RecA.
2. Гиперактивность белка RecA, измеряемая генетически, сопряжена с изменением его структурно-функциональных характеристик, сопряженных с
   • увеличением сродства белка к он- и днДНК;
   • увеличением сродства первого, а не второго, сайта RecA к онДНК;
   • увеличением скорости и эффективности вытеснения белка SSB с онДНК;
   • способностью белка RecA инициировать рекомбинацию как с 3'-конца, так и с 5'-конца онДНК;
   • ослабленной зависимостью от белков-помощников.
3. Даже замены отдельных аминокислот у RecA (точечные повреждения) могут приводить к гиперрекомбинации. Однако такие замены могут воздействовать разнонаправлено, улучшая одни и ухудшая другие основы многопараметрового явления гиперрекомбинации.
4. Хотя активация белка RecA сопряжена со структурными изменениями в относительном расположении его доменов, гиперактивация не связана с дополнительными изменениями структуры его филамента.

Подобный структурно-функциональный анализ, в конечном счете, и должен привести нас к пониманию биологических последствий гиперрекомбинации.

Сравнительный функциональный анализ главного фермента гомологической рекомбинации в трех доменах живого

RecA-подобные белки распространены повсеместно, т.е. во всех трех доменах живого: Bacteria, Archaea и Eukarya. В двух последних они называются RadA и Rad51, таким образом образуя суперсемейство RecA/RadA/Rad51-подобных белков. Функциональное подобие этих белков (при выраженных различиях первичной структуры) в том, что все они в присутствии АТФ образуют спиралевидный филамент на онДНК, который переводит белок в активное состояние и делает его способным спариваться с днДНК и производить обмен этой онДНК на себе подобную в днДНК.

Среди прокариот-бактерий мы изучаем уже упомянутые выше белки RecA из E. сoli и Ps. aeruginosa; планируем начать работу с RecA из Deinococcus radiodurans как самого яркого представителя гиперрадиоустойчивых микроорганизмов.

Архебактерии, принадлежащие, как представляется, к наиболее ранним формам живого, содержат элементы как про-, так и эукариотической структуры генома. Белок RadA по своим биохимическим свойствам ближе к Rad51, чем к RecA. Особенность белков RadA из Desulfurococcus amylolyticus и Pyrobaculum islandicum, анализируемых нами, в том , что они должны работать при аномально высоких температурах, в условиях обитания их гипертермофильных хозяев. Нам удалось выявить две интересных особенности этих белков:

1. оба белка обладали двумя выраженными модами АТФазной активности до и после критической температуры (70-75С);
2. белок из D. amylolyticus способен переносить нить ДНК даже при температурах плавления ДНК.

Однако много вопросов, касающихся функционирования этих гипертермофильных белков и их псевдоаналогов (типа RadB), еще ждут своего решения.

Из белков Rad51 низших эукариот мы изучаем два: один из термотолерантных дрожжей Pichia angusta и второй из микроводорослей Сhlamydomonas reinhardtii. Ожидаемая особенность первого в том, что он должен быть термотолерантным, как и его хозяин. Второй Rad51 оказался в окружении паралогов таких, как Rad51B, Rad51C и др., т.к. микроводоросли, подобно высшим эукариотам, имеют слабую и достаточно сложно контролируемую систему гомологической рекомбинации из-за наличия повторов в структуре их генома. Вместе с тем, они представляют собой более простой и биотехнологически ценный объект исследования.

Изучение связи процессов когезии сестринских хроматид и различных путей репарации ДНК

Механизмы поддержания целостности генома у эукариот являются одной из наиболее интенсивно изучаемых областей современной биологии. Клетки всех эукариотических организмов, от дрожжей до человека, наследуют генетическую информацию на хроматидах. Чтобы разделить каждую хромосому, дуплицировавшуюся в ходе репликации при митозе или мейозе, каждая дочерняя клетка должна получить одну копию хромосомы или хроматиду.
В противном случае судьба дочерних клеток с недостаточным или избыточным числом хроматид печальна. Так, человеческие эмбрионы с неправильным хромосомным набором в большинстве случаев погибают, а в случае их выживания приводят к серьезным дефектам у новорожденных.
Подобные нарушения в клетках человека в более позднем возрасте часто приводят к злокачественным опухолям.

История изучения процесса, получившего название когезии сестринских хроматид, насчитывает немногим более пяти лет. Доказано, что хроматиды остаются сцепленными друг с другом с момента их синтеза при помощи специализированного белкового комплекса – когезина. Именно механизм когезии лежит в основе известного по данным микроскопии распределения хромосом в центре митотического веретена и последующего одновременного расхождения их к противоположным полюсам.

Другим биологическим процессом, непосредственно связанным с поддержанием целостности генома, является репарация повреждений в ДНК. Значительная часть повреждений в хромосомной ДНК устраняется на этапе, когда хромосомы присутствуют в клетке в виде пар сцепленных между собой сестринских хроматид, т.е. с момента репликации ДНК до анафазы в митозе (или анафазы I в мейозе). При этом наиболее удобным способом репарации является использование неповрежденной сестринской хроматиды в качестве партнера при рекомбинации.

Современный взгляд на проблему поддержания гомеостаза в клетке подразумевает изучение взаимосвязи между двумя фундаментальными биологическими процессами – когезией сестринских хроматид и репарацией повреждений в ДНК.

Возникает вопрос, к каким последствиям для репарации приводят мутации в генах, кодирующих субъединицы белкового комплекса, обеспечивающего когезию? В задачи данного проекта входит исследование влияния нарушений когезии сестринских хроматид, связанных с различными мутациями в белках когезина, на репарацию различных повреждений ДНК; определение путей репарации ДНК, на которые влияют эти мутации, и создание представлений о связи определенного пути (путей) репарации ДНК c когезией.

Канцерогенез: aнализ профиля генетических повреждений при развитии раков желудочно-кишечного тракта; наследственные и спонтанные повреждения системы коррекции неспаренных оснований ДНК

Процесс канцерогенеза характеризуется накоплением необратимых изменений клеточного фенотипа, в основе которых лежат генетические изменения, сопровождающиеся клонированием эпителиальных клеток с новым генотипом.

В человеческих раках описаны разные виды генетической нестабильности, в числе которых повреждения системы коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО), приводящие к возникновению опухолей с фенотипом микросателлитной нестабильности MSI (от англ. microsatellite instability). MSI встречается среди наследственных (наследственный неполипозный рак толстой кишки, или ННРТК), а также спорадических карцином, примерно в 10-15% колоректальных, желудочных раков и раков эндометрия. Микросателлиты обнаружены в кодирующих областях многих генов, репликация которых приводит к мутациям сдвига рамки считывания. Накопление таких изменений в рецепторах факторов роста, транскрипционных и проапоптозных факторах, мембранных белках, регуляторах клеточного цикла (кодируемых такими генами, как TGFBRII, BAX, E2F4, IGFIIR, BLM, генами системы КНО hMSH3 и hMSH6) является основным молекулярным механизмом, с помощью которого клетки с MSI приобретают функциональные изменения с возможным онкогенным действием.

В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что в процесс патогенеза спорадических и наследственных раков желудочнокишечного тракта (ЖКТ) и эндометрия с фенотипом MSI вовлечены также гены рекомбинационной репарации ДНК.

Субстратами рекомбинационной репарации являются двунитевые разрывы и однонитевые бреши, возникающие в ДНК под действием, например, ионизирующего излучения. Система рекомбинационной репарации у человека состоит из двух взаимосвязанных ATM- и Rad51- ветвей. Многие гены, относящиеся к первой ветви, такие, как гены RAD50+ MRE11+NBS1 комплекса, отвечающего за узнавание двунитевых разрывов, ген BRCA1 и центральный ген ATM, содержат различные микросателлиты в экзоннных или интронных последовательностях. Фактически повреждения системы КНО могут привести (через повреждения генов-мишеней) к нарушениям системы рекомбинационной репарации, что, в свою очередь, может повлечь за собой различные биологические последствия при прогрессии опухолей с фенотипом MSI.

Кроме того, следует иметь в виду тот факт, что для большого числа спорадических раков с MSI причиной дефектной работы системы КНО является гиперметилирование CpG- островков промоторного участка гена hMLHI. Поскольку метилирование не есть локальный процесс, то в него вовлекаются и другие онкосупрессорные гены. Например, показано, что в колоректальных раках с высокой вероятностью встречаются гиперметилирование CpG- островков в промоторных областях генов p16 (ген ингибитора циклин-зависимых киназ), THBS1 (ген тромбоспондина 1) и некоторых
других.

Эти данные позволяют расширить спектр возможных последствий, к которым приводят дефекты системы КНО, и заставляют при установлении генетической основы патогенеза таких опухолей вносить дополнительные маркеры.

В рамках данной работы проводятся исследования по установлению последовательности генетических или эпигенетических (например, нарушение метилирования определенных участков генома) событий, происходящих в эпителиальных клетках ЖКТ при прогрессии наследственных и спорадических опухолей.

ПЦР-диагностика генетических путей развития рака желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека

Группа мутаций, определяющих развитие неоплазии (мутационный профиль), и наиболее вероятная последовательность их появления составляют генетический путь развития опухоли. Следствиями различия мутационных профилей опухолей явлются разное течение онкологического заболевания и отличия в чувствительности опухолевых клеток к разным видам терапии, поэтому проблема выявления генетических путей развития злокачественных новообразований ЖКТ человека весьма актуальна.

К настоящему времени для злокачественных опухолей ЖКТ известны два основных пути – p53-зависимый и “мутаторный” путь. Первый характеризуется возникновением мутаций в генах APC, K-ras, DCC и p53. Мутации в гене р53 являются наиболее общими для злокачественных новообразований человека различной локализации. В случае раков ЖКТ они происходят на последнем этапе, перед развитием инвазивных свойств опухоли и выявляются у 60% больных спорадическим раком данной локализации.

В норме белок р53 участвует в регуляции механизмов, отвечающих за сохранность клеточного генома, приостанавливая клеточный цикл в фазе G1 при повреждениях ДНК и инициируя их репарацию. Если степень повреждений слишком высока для эффективной репарации, белок р53 индуцирует программируемую гибель клеток – апоптоз. Клетки, несущие мутации в гене р53, не способны предотвращать накопление повреждений ДНК при генерации, тем самым увеличивая темп мутагенеза, что, в частности, приводит к способности клеток оставаться жизнеспособными в необычном для них окружении и метастазированию.

Основой мутаторного пути является выход из строя системы коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО). Наряду с другими, эта репаративная система контролирует точность репликации ДНК, повышая ее на два порядка. Нарушение КНО приводит к появлению неспаренных оснований. Известной ошибкой ДНК-полимеразы является ее способность “проскальзывать” на повторяющихся буквах генетического кода, что приводит к делетированию или вставке части повтора. Делеция или вставка одногодвух нуклеотидов приводит к мутации сдвига рамки считывания. Cистема КНО исправляет различные, в том числе и такие, ошибки. Повреждения генов hMSH2 и hMLH1 системы КНО обнаружены у более 80% пациентов с наследственным неполипозным раком толстой кишки (ННРТК) и у 10-15% спорадических карцином толстой кишки, желудка, эндометрия и яичников.

Имеющиеся в настоящее время данные по механизмам воздействия химиотерапевтических препаратов на клетки опухолей показывают, что ус¬тойчивость к ним клеток - феномен сложный и многофакторный. Напри¬мер, клетки с нарушениями функции системы КНО, как правило, устойчивы к у-облучению, препаратам, содержащим платину, таким, как цисплатин и карбоплатин, алкилирующим и метилирующим агентам, ингибиторам топо-изомеразы II (доксорубицин и этопозид), 5-фторурацилу, но чувствительны к трансплатину, оксалиплатину и таксанам. Кроме того, изначально чувст¬вительная опухоль может приобрести мультирезистентность к антирако¬вым агентам после воздействия одного из них и фактически приобрести фенотип КНО-зависимой опухоли. Мультирезистентность обусловлена потерей клеткой способности к апоптозу, который является конечным звеном цитотоксического действия антираковых препаратов на клетку.

Чувствительность клеток с мутациями в гене р53 к цисплатину, окса-липлатину и трансплатину зависит от генетики конкретных клеточных линий, т. к. белок р53 находится в центре сложного регуляторного каскада и может косвенно модулировать чувствительность клеток к этим терапевтическим агентам. В то же время, чувствительность клеток к аналогу трансплатина -JМ335 (образующему ДНК-платиновые аддукты с конформацией, отличной от конформации аддуктов, возникающих в результате действия цисплатина, оксалиплатина и трансплатина) гораздо более универсальна и не зависит от повреждений гена р53.

Поэтому ясно, что для выбора эффективной терапии рака важно уметь определять, с каким генетическим путем сопряжено развитие данного заболевания. Помимо этого, при рецидивах болезни необходимо проверять, не возникла ли в ходе лечения устойчивость к антираковым агентам.

Отсюда и определилась цель данного проекта, которая состоит в выявлении принадлежности опухолей ЖКТ к одному из двух основных генетических путей развития.

Для этого мы выбираем микросателлиты, наиболее чувствительные к дефектам системы КНО и с их помощью анализируем клеточную ДНК на наличие микросателлитной нестабильности ее генома. Это позволяет выработать простую процедуру диагностирования пути прогрессии карциномы.

ПЦР-диагностика опасных бактериальных и вирусных инфекций

1. Применение полимеразной цепной реакции в клинической диагностике и мониторинге лечения туберкулеза у детей
   Эпидемическая ситуация по туберкулезу осложнилась в России в начале 90-х годов. К 2003 году численность больных еще увеличилась более чем в 2 раза и в 1,5 раза возросла смертность. Главная проблема сегодня – большое количество не выявленных больных туберкулезом. Последние или из-за нежелания лечиться или из-за отсутствии ярких симптомов годами являются распространителями инфекции среди окружающих людей. В связи с этим ясно, какую роль приобретает своевременная диагностика туберкулеза.

   Нами был разработан и апробирован высокочувствительный четырехпраймерный ПЦР-диагностикум туберкулеза “Амплитуб-К”. Его применение позволяет в течение нескольких часов обнаруживать уникальные последовательности ДНК, специфичные для микобактерий туберкулеза (МБТ). По своей чувствительности (1–10 микробных клеток в реакции) ПЦР значительно превосходит бактериоскопические и даже культуральные методы выявления МБТ. К преимуществам этого метода относятся как скорость выявления инфекционного агента, так и чувствительность анализа, что особенно важно в случаях дифференциальной диагностики у абациллярных больных.

   Использование этого ПЦР-теста в сопоставлении с клиническими данными позволило повысить качество диагностики туберкулеза, особенно при обследовании детей, больных неспецифическими заболеваниями легких и инфицированных МБТ. Кроме того, использование “Амплитуба-К” дает возможность проводить мониторинг лечения разных форм заболевания.

   Проект выполняется в сотрудничестве с отделением туберкулеза легких у детей НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ и с кафедрой туберкулеза Педиатрической академии МЗ РФ.

2. Изучение динамики цитомегаловирусной инфекции и особенностей патогенеза заболеваний у реципиентов костного мозга с помощью количественной ПЦР

   Цитомегаловирус (ЦМВ) широко распространен во всех популяциях человека. По данным серологических обследований до 90% взрослого населения ЦМВ-серопозитивны. У здоровых людей первичная инфекция обычно либо асимптоматична, либо имеет мягкий характер. После первичной инфекции ЦМВ, как и другие герпетические вирусы, пожизненно персистирует в организме хозяина в латентной форме, периодически проявляя эпизоды реактивации. У иммунокомпетентных людей реактивация может клинически не проявляться, хотя инфекционный вирус может выделяться различными органами. Стратегия вируса, по-видимому, состоит в сбалансированных взаимоотношениях между вирусной репликацией и иммунным ответом хозяина. При иммуносупрессии организма у больных СПИДом, реципиентов органов и костного мозга (КМ) ЦМВ часто является причиной заболеваний с летальным исходом.

   В ЛМГ ПИЯФ РАН разработан высокочувствительный ПЦР-диагностикум для определения количества ДНК ЦМВ в клинических образцах.
   В настоящее время проводятся исследования цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) у гематологических больных после трансплантации КМ. Аллогенная трансплантация КМ и гемопоэтических стволовых клеток является высокоэффективным методом лечения как наследственных, так и злокачественных гематологических заболеваний. Число выполненных пересадок растет с каждым годом. Чувствительный количественный мониторинг ЦМВИ особенно актуален для этой группы больных. Целью исследования является определение клинически значимых параметров инфекции: уровней и динамики вирусного груза при развитии инфекции и в ходе противовирусной терапии.